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RT-PCR技术

RT—PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用,从RNA合成cDNA,再以cDNA为模板,在DNA聚合酶作用下扩增合成目的片段。RT—PCR技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基因表达水平、细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA,关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发夹结构的真核细胞mRNA,3种都可。 [1]

RT-PCR技术 操作步骤

cDNA第一链合成方法:20ul反应液中含10xPCR扩增缓冲液,2ul;四种dNTP(10 mmol/L)2ul;RNA酶抑制剂20U;mRNA,l~2ug(或RNA 5-10ug);AMV,20U;引物,1u;最后用灭菌水补至20ul。 以上溶液充分混匀后,于42℃反应60min,反应完毕后将反应管在95℃下加热5min,使反转录酶失活和RNA—cDNA杂合物变性。其后反应液则可置于-20℃下保存备用。 [2]

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什么是液滴数字PCR?

PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应)技术是指在体外环境下,人工模拟生物体内DNA复制环境,将特定DNA片段进行大规模复制的一种技术,其操作流程如下图所示。

目前PCR技术已发展至第三代——液滴数字PCR(Droplet Digital PCR, ddPCR)。ddPCR是一种基于液滴平台的核酸分子定量技术,其将PCR与液滴微流控技术相结合,在PCR扩增前对样品进行液滴化处理,将待检样品均匀“什么是期权市场的PCR指标? 分配”到成千上万个纳升级别的液滴,每个液滴之间相互隔离,为一个单独的反应体系,可单独完成PCR扩增,从而在短时间内便可完成DNA片段的指数级扩增。随后对液滴进行逐一分析,将液滴中含靶基因片段与不含靶基因片段的液滴分别标为1和0,再结合泊松分布,可计算出待检样品中的靶基因分子的具体个数或浓度。因此,ddPCR能实现核酸分子高灵敏、高准确、高特异性的定量,在核酸检测时展现出以下优势:

液滴数字PCR的应用

2.稀有突变检测:当生物标志物存在于高度丰富的对应物背景中,且仅存在单个核苷酸变异(single nucleotide variant,SNV)不同时,就会发生稀有突变检测。ddPCR能够在200,000倍过量的野生型背景环境下检测突变DNA,比常规qPCR灵敏度高2,000倍。

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师姐呕心沥血整理的 qRT-PCR 注意事项

但是实验室一般不会有 Agilent 2100 Bioanalyzer,在这种情况下,我们可以通过甲醛胶检测,但是对 RNA 总量的要求高,那么最快速的方法就是用普通的凝胶电泳。要求在 nuclease-free 的环境下,所以需要将电泳槽、溶胶瓶、凝胶托槽以及梳子用 DEPC 水冲洗干净。琼脂糖也是 nuclease-free(只要是新开封的就行),Loading Buffer 尽可能是新开封的,配置 1.2% 的凝胶。

注意,凝胶一定要保证溶解完全,要不然会导致条带不均一,如图中样品 9。电压太高或者跑太长时间会产热,导致 RNA 降解,所以要合理控制电压和时间。此外,跑胶也可以进一步确定样品中是否有 DNA 的残留,观测点胶孔是否有大量滞留的条带。

你确定你的 cDNA 的浓度吗?

实验室大师兄的经验是每次反转得到的 20 ul 体系的 cDNA 直接稀释 20X,而博后师姐是按照 10X 稀释,我一般是看情况而定。因为每个人提的 RNA 质量不同,反转的水平也分高低,再说反转的技术也未必稳定。

所以在每次拿到反转的 cDNA 后,我首先会稀释 3 倍左右,然后利用管家基因做一次 RT-PCR,循环数一般为 25 cycle,鉴定一下具体浓度,再决定最后的稀释倍数。

你确定你的引物好用吗?

可以通过 qRT-PCR 的溶解曲线,但是呢,这个还是要耗钱的。对于没有很多钱的实验室来说,在拿到很多引物的时候,可以通过普通的 RT-PCR 看看是否是单一条带,鉴定一下引物的特异性。如果实验室不差钱,则可以通过溶解曲线对所有的引物的特异性做一次鉴定。

你确定你的 PCR 板和仪器配套吗?

如果你用的是 BIO-RAD 公司的定量 PCR 仪器,那么你一定要买配套该仪器的 qRT-PCR 板。因为不兼容的 PCR 板会导致结果偏差。因为我的师姐就真的碰到过这种情况。

你确定你的实验条件合适吗?

SYBR 要避免强光照射,所以在加 SYBR 试剂的时候尽量关掉头顶的照明灯,只需借助微光完成就可以。

SYBR 放置 4 ℃ 保存,使用时轻轻上下颠倒混匀即可,避免泡沫产生,切忌用力涡旋。

有些小师妹怕自己加样搞混,喜欢在 PCR 板上划出标志,这样做是不对的。因为你的标记极有可能影响到荧光信号的采集,所以一般我会建议师妹采用实验记录本协助记忆,如下所示。

你确定你的操作正确吗?

为了减少 SYBR 在光下的曝光,个人喜欢先加入模板, 如下图。根据经验,少量模板的加入,容易造成加样误差。所以为了尽量减少加入少量模板造成的误差,我一般会将样本再稀释一倍,加样的时候多加一倍,减少 H 2 O 2 的加入量。

然后配置 qRT-PCR 体系,如下。

加好样品后,贴好透明封板膜。尽量不要用手碰透明封板膜的表面,从膜两边空余处操作就行。因为手印也有可能可能影响到荧光信号的采集。然后就是用离心机低速迅速离心 10 S,防止样本挂壁。

好了,基本的操作部分以及注意事项就这么多,希望能帮到大家。想看更多,点击阅读原文,有 PCR 合集 操作视频,包括普通 PCR、RT-PCR、qPCR等。